Аддиктология. Наркология. Алкоголизм. Зависимости.

Вклад нейромедиаторных систем мозга в механизм действия амфетамина

Авторы: Башкатова В.Г., Судаков С.К., Крауз М., Праст Г.

В работе был исследован эффект четырехкратного введения психостимулятора амфетамина на высвобождение ацетилхолина и генерацию оксида азота (NO) в мозге крыс линии Спрэг-Доули. Установлено, что субхроническое введение амфетамина сопровождалось значительным увеличением уровня ацетилхолина в диализате. Обнаружено, что введение ингибиторов NO-синтазы в значительной степени предотвращало усиление высвобождения ацетилхолина в прилежащем ядре, обусловленное введением амфетамина. Полученные данные позволяют рассматривать холинергическую и нитроергическую системы мозга, как мишени для создания новых оригинальных препаратов, которые могут модулировать эффекты, вызываемые психомоторными стимуляторами.

В настоящее время механизм действия амфетамина и его производных принято связывать в основном с активацией дофаминергической нейропередачи в нигростриатных и мезолимбических путях, обусловленной повышением внеклеточной концентрации дофамина в соответствующих структурах мозга. Однако установлено, что в механизмах патофизиологических эффектов амфетаминов важную роль могут играть не только нарушения отдельных звеньев дофаминергической передачи, но и другие нейротрансмиттерные системы, в том числе холинергическая. В то же время, данные о влиянии различных доз амфетамина и метамфетамина на активность холинергической системы, в частности, на высвобождение ацетилхолина из различных областей мозга, немногочисленны и фрагментарны. Так, ранее считалось, что введение этих психостимуляторов уменьшает высвобождение ацетилхолина из стриатума. С другой стороны, имеются данные об усилении высвобождения этого нейромедиатора из стриатума и прилежащего ядра мозга крыс. В ряде исследований последнего времени, в том числе выполненных и нами, было установлена важная роль нейронального мессенджера нового поколения оксида азота (NO) в патогенезе состояний, обусловленных нарушением дофаминергической нейропередачи. Целью работы явилось изучение участия холинергической системы мозга и оксида азота (NO) в условиях четырехкратного введения амфетамина.

Материал и методы исследования

Эксперименты были выполнены на крысах линии Спрэг-Доули (Sprague-Dawley) из питомника медицинского факультета Университета г. Инсбрука (Австрия). Эксперименты проводились в соответствии с требованиями приказа No 267 МЗ РФ (19.06.2003 г.), а также в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных в Австрии» (Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst, Austria, Kommission für Tierversuchsangelegenheiten). Животные содержались в клетках по 6 особей в каждой при свободном доступе к воде и стандартному комбинированному корму. С целью избежания влияния суточных ритмов на поведенческие параметры животных все эксперименты проводились в период между 9 и 14 часами при средней температуре лабораторного помещения 22 °С.

D,L-амфетамин (Sigma) в дозе 5 мг/кг, внутрибрюшинно (в/б) вводили 4 раза с интервалом в 2 ч. Эта схема достаточно широко используется для изучения эффектов амфетаминоподобных психостимуляторов и предусматривает введение препарата в дозах, однократная инъекция которых вызывает выраженный психостимулирующий эффект, но не сопровождается появлением признаков повреждения нервных клеток. В работе были использованы следующие ингибиторы NO-синтазы: 7-нитроиндозол (7NI, Sigma), действующий селективно на нейрональную NO-синтазу, и не обладающий избирательностью N-нитро-L-аргинин (L-NNA, Sigma). 7-NI вводили в дозе 50 мг/кг в/б за 30 мин до 1-й инъекции амфетамина. L-NNA вводили в дозе 100 мг/кг в/б по той же схеме, что и 7-NI.

Для оценки внеклеточного уровня ацетилхолина в условиях перфузии прилежащего ядра мозга использовали метод микродиализа. Образцы диализата собирали каждые 10 мин. После сбора 3-х базальных образцов животным вводили 0,85% раствор NaCl или исследуемое вещество. Содержание ацетилхолина в диализатах определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией. Диализаты анализировали немедленно или сохраняли при температуре –70 °С (но не более 2-х недель). Для разделения и количественной оценки содержания ацетилхолина использовали хроматографическую систему с электрохимическим детектором (BAS, США), аналитические колонки Chromspher 5, С18, 100х3 мм с подвижной фазой, состоящей из 100 мМ фосфатного буфера, 5 мМ KC1, 1 мМ тетраметиламмония гидрохлорида, 0,1 мМ ЭДТА. Ацетилхолин подвергали гидролизу до ацетата и холина, используя специальный реактор, после чего холин окисляли холиноксидазой до бетаина и перекиси водорода. В качестве детектора применяли платиновый электрод при 500 mV. Порог детекции ацетилхолина составлял 30 фмоль на образец. Среднее содержание ацетилхолина в базальных образцах принимали за 100%, эффекты амфетамина оценивали по отношению к базальному уровню.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием теста Фридмана и рангового теста Вилкоксона.

Результаты исследования

В результате наших экспериментов установлено, что базальный выход ацетилхолина составлял 25,1 ± 9,1 фмоль/мин. При введении амфетамина в дозе 5,0 мг/кг в/б уже через 20 мин после первого введения психостимулятора концентрация ацетилхолина в диализате достоверно превышала исходный уровень (рис. 1). Затем содержание ацетилхолина продолжало увеличиваться и достигало максимальных значений через 20–40 мин после следующего (2-го) введения препарата. Последующие инъекции амфетамина сопровождались также выраженными подъемами уровня исследуемого нейротрансмиттера (рис. 1). Следует отметить, что концентрация ацетилхолина в диализате оставалась значительно повышенной по сравнению с базальным выходом этого нейромедиатора до конца эксперимента, т.е. спустя 3 ч после последнего (4-го) введения амфетамина. Таким образом, в результате проведенных исследований обнаружено, что 4-х кратное (с интервалом 2 ч) введение D,L-амфетамина в дозе 5 мг/кг в/б вызывает увеличение уровня ацетилхолина в перфузате более чем в 4 раза.

Результаты опытов по изучению влияния ингибиторов NO-синтазы L-нитро-L-аргинина и 7-нитроиндозола на высвобождение нейромедиатора ацетилхолина из nucleus accumbens при субхроническом введении амфетамина представлены на рис. 1. Как видно из этого рисунка, предварительное введении неселективного ингибитора NO-синтазы L-NNA в дозе 100 мг/кг в/б за 30 минут до 1-й инъекции амфетамина в значительной степени предотвращало усиление выхода ацетилхолина, индуцированное субхроническим введением амфетамина. Сходные результаты были получены и при изучении эффекта селективного ингибитора нейрональной NO-синтазы 7-NI, который при применении в дозе 50 мг/кг в/б в те же сроки в еще большей степени предупреждал вызванный амфетамином повышенный выход нейромедиатора из прилежащего ядра (см. рис. 1). Таким образом нами показано, что ингибиторы NO-синтазы N-нитро-L-аргинин и 7-нитроиндозол в значительной степени, но не полностью предотвращали увеличение выхода ацетилхолина, причем наиболее выраженный эффект наблюдался при введении селективного ингибитора нейрональной NO-синтазы.

Обсуждение результатов исследования

Известно, что амфетамин и его аналоги относятся к веществам, способным вызывать лекарственную зависимость, при этом, в первую очередь, они оказывают селективный эффект на дофаминергические нейроны. Однако в то время как влияние амфетамина и метамфетамина на дофаминергические и серотонинергические нейроны достаточно хорошо изучены, возможный вклад других нейромедиаторных систем мозга в механизм действия данного психостимулятора остается до сих во многом неясным. Анализ литературы показывает, что имеющиеся в литературе данные о влиянии амфетамина на высвобождение ацетилхолина достаточно противоречивы. В наших экспериментах установлено, что четырехкратное (с интервалом 2 ч) введение D,L-амфетамина вызывает значительное увеличение уровня ацетилхолина в перфузате. По-видимому, усиление высвобождения ацетилхолина в стриатуме, обусловленное амфетамином, осуществляется при активации дофаминовых рецепторов 1-го типа. Обобщая эти результаты, можно предположить, что дофамин играет ключевую роль в усилении высвобождения ацетилхолина, индуцированного введением амфетамина.

Анализ данных литературы о механизмах действия психомоторных стимуляторов свидетельствует о важной роли нитроергической системы мозга в этих процессах. Ранее нами было показано, что субхроническое введение психомоторных стимуляторов сопровождается значительным увеличением генерации NO и активацией процессов перекисного окисления липидов в стриатуме и коре мозга крыс. Сходные данные были получены и авторами, использующими другие, в основном косвенные методы определения NO. Так, показано, что однократное введение амфетамина вызывало достоверное увеличение содержания нитратов/нитритов в стриатуме. Работами последних лет выявлено, что метамфетамин вызывает усиление образования в мозге 3-нитротирозина, который может рассматриваться как биомаркер пероксинитрита. Участие NO-синтазы в механизмах повреждающего действия NO подтверждается тем, что трансгенные мыши, дефицитные по нейрональной NO-синтазе, проявляют устойчивость к введению метамфетамина в токсических дозах. Вместе с тем показано, что ингибитор NO-синтазы – метиловый эфир L-нитро-аргинина, вызывает уменьшение показателей стереотипного поведения и не снижает повышенный уровень дофамина, обусловленный введением метамфетамина. Полученные данные позволяют авторам сделать предположение о том, что эти эффекты ингибитора NO-синтазы могут осуществляться путем модулирования активности постсинаптических дофаминовых рецепторов. Так наблюдавшийся в наших опытах наиболее выраженный эффект селективного ингибитора нейрональной NO-синтазы 7-нитроиндозола может означать, что индуцированная амфетамином стимуляция холинергической нейропередачи модулируется главным образом при участии нейрональной NO-синтазы. Таким образом можно заключить, что в механизм действия амфетамина максимальный вклад вносит именно нейрональная NO-синтаза. В заключение, полученные нами данные позволяют рассматривать холинергическую и нитроергическую системы мозга, как мишени для создания новых оригинальных препаратов, которые могут модулировать эффекты, вызываемые психомоторными стимуляторами.

 

Редакция

Мы в соцсетях